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      熒光顯微鏡為何要選擇不同濾色片?

      作者:激發光源事業部時間:2019-12-04 07:42:07瀏覽993 次

      信息摘要:

      帶通濾光片通常通過中間波長和區間寬度確定。在較為簡單的熒光顯微鏡裝置中,一旦激發光線離開激發濾光片,即會照射到靶標上,靶標上的熒光基團隨即變為激發狀態,然后發射向光譜的紅外端遷移的光線。

      顯微鏡的放大率和分辨率之間的區別
      了解熒光成像時要獲得良好結果時,了解放大倍率和分辨率之間的區別非常重要。當談論放大倍數時,我們指的是在顯微鏡下觀察物體時會出現多大的物體。相反,當我們從實際意義上談論分辨率時,我們指的是我們可以在圖像中區分多少細節,這可能是主觀的。從技術上講,分辨率受光的折射特性限制。

      使用熒光可以提高分辨率
      分辨率和放大率不一樣。在顯微鏡下,我們將放大圖像中可見的細節稱為分辨率。如果您看不到放大后的樣本中的細節,則放大或使某些內容看起來變大不會有什么好處。明視野顯微鏡依賴于由于樣品各個部分之間的密度差異而導致的光吸收差異,就我們的目的而言,這就是細胞。因此,當您想在細胞中看到許多細節時,明場顯微鏡并不是很好。您如何提高分辨率?加入熒光團以染色樣品中的結構,并過濾以照亮樣品,聚焦樣品發出的光,添加靈敏的檢測器,瞧!現在您可以進行熒光顯微鏡檢查了。熒光顯微鏡通過使細胞中的各種結構形成對比,為您提供了更好的分辨率的優勢 與他們的鄰居更好,并且允許您收集一種以上顏色的圖像。


      熒光顯微鏡基本結構:
      大部分熒光成像通過熒光顯微鏡完成,其包括以下基本元件:
      ?光源: 通常是氙弧燈或汞燈,但近年來也使用高功率LED
      ?濾光片(入射光): 將入射光波長縮減到只留下用于激發樣品的波長,有趣的是,其被稱為激發濾光片
      ?二向分色鏡或反射鏡:  將激發光反射到樣品上,并同時只通過來自樣品的發射光,傳遞到檢測儀(如下圖)

      ?濾光片(發射光): 只能通過來自樣品的發射光波長,并阻擋所有通過激發濾光片的光線,如您所想,其被稱為發射濾光片
      ?CCD照相機: 發射光如果不能檢測到,則沒有任何用處;對于熒光成像來說,檢測儀通常是CCD照相機,這種照相機一般也連接到電腦屏幕,能夠為您呈現圖像。

      熒光顯微鏡中的光路
      照射和發射光通過同個物鏡的設計被稱為落射熒光顯微鏡(epifluorescence microscopy),詞中的“epi”借用自希臘語,意為“相同”,更加準確的說法應是落射熒光照明,但是因為熒光依賴于照明,所以人們默認省略了照明部分。透射照明熒光顯微鏡不常見,但是您也可能遇到放置樣品的載物臺在中間,照射和信號收集在其兩側的設置方法。

      放大倍數與分辨率
      放大倍數:為了在熒光成像中獲得良好結果,理解放大倍數和分辨率的區別很重要。當提到放大倍數,指的是當我們在顯微鏡下觀察一個對象時,它比原本放大了多少(圖4)。
      分辨率:與此相反,實際意義上的分辨率指的是圖片中我們能夠分辨多少細節,這可能是主觀的。從技術層面更深入地講,分辨率受到光的折射特性的限制。

      熒光顯微鏡的極限分辨率
      它指典型的落射熒光照明復合顯微鏡無法分辨或區分距離小于200 nm的兩個物體。此外,因為整個樣品被同時照射,所以樣品中所有聚焦和離焦的光線都被檢測到。這些限制意味著,根據物鏡中的鏡片,您可能能夠確定一個細胞中的兩個不同顏色的探針,但是如果沒有很多對照、單像素分析和計算,就無法分辨它們之間的空間關系。此外,因為您沒有掌握任何深度相關信息,所以無法從落射熒光顯微鏡拍攝的圖片中得到關于體積的可靠結論。通過了解系統的限制,您能夠對獲得的數據和圖像更加確信,也能夠完全理解您的數據并明確表達結論。
       激光掃描共聚焦顯微鏡也依賴于復合光顯微鏡設置,但能夠獲得更高的分辨率。其分辨率的提高源于使用激光作為照明,其將激發光范圍縮窄到~2-3nm。這比使用激發濾光片組準確十倍。此外,一次實驗中只從一個焦平面獲得圖像,使用針孔阻擋離焦光線到達檢測儀,可以去除所有分散和離焦光線,從而提高了分辨率對單個焦平面的限制,這被稱為選擇性分區。這種針孔只允許來自樣品很窄區間的光線通過,所以能夠改善深度方面的信息。這比使用落射熒光獲得的分辨率有所提高,落射熒光收集一個細胞中很多焦平面的光線??蒲腥藛T也可以通過其他選擇獲得更高的分辨率,但是這些方法更加專業化,并需要更多的技術知識才能著手。

      正置和倒置顯微鏡
      有時候聽到人們稱顯微鏡為正置或者倒置,這些術語指的是一些元件的位置,如物鏡和光源。正置顯微鏡的物鏡在放置樣品的載物臺之上;倒置顯微鏡的物鏡在放置樣品的載物臺之下。正置和倒置顯微鏡產生和引導光線通過不同路徑的能力并沒有根本不同。其實您所能獲得的圖像質量與樣品制備、鏡片、光源和波長、染料濾光片組設置以及照相機等更加相關,而非顯微鏡元件的位置。一些實驗需要特定方向才能獲得所需的結果,所以觀察一臺沒用過的顯微鏡并全面考慮實驗步驟以確定其設置符合您的實驗需要,這始終是一種明智的做法。

      濾光片可幫助您在成像時控制光線
      將濾光片組放在熒光顯微鏡的不同光點上,即可設定激發樣品的光線波長,以及在熒光發射時檢測到的波長。

      DAPI染料的激發光和發射光的濾光片

      熒光成像使用的濾光片的不同類型
      通常情況下,濾光片組被設計成可用于捕獲指定熒光團的更大激發和發射波長,但不會捕獲所有的熒光。多數現代化濾光片組的設計旨在確保激發濾光片只允許指定波長區間的光線通過。這種類型的濾光片稱為帶通濾光片(band-pass filter)。帶通濾光片通常通過中間波長和區間寬度確定。在較為簡單的熒光顯微鏡裝置中,一旦激發光線離開激發濾光片,即會照射到靶標上,靶標上的熒光基團隨即變為激發狀態,然后發射向光譜的紅外端(相對于激發光線)遷移的光線。并非所有此類發射光線都會被檢測器捕獲到——僅那些允許通過二向分色鏡且能通過發射濾光片的光線。發射濾光片通常為帶通濾光片或長通濾光片,具體取決于特定的熒光團和成像實驗。如果您希望讓超過特定波長的光線通過檢測器,可選擇長通濾光片.

       文章內容摘自:賽默飛公司產品資料


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