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      綠色熒光蛋白GFP

      作者:激發光源事業部時間:2019-12-20 10:31:28瀏覽414 次

      信息摘要:

      綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態下產生熒光,強還原劑能使GFP轉變為非熒光形式,但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光,中度氧化劑如生物材料的固定,脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。

      綠色熒光蛋白GFP

      綠色熒光蛋白(GreenFluorescent Protein,簡稱GFP)是在美國西北海岸所盛產的一種名為Aequorea victoria的水母中發現的一種可以發出綠色熒光的蛋白質。GFP最早是在1962年由日本科學家下村修發現,是由238氨基酸組成的單體蛋白質,蛋白分子量約為27kD。GFP的晶體結構顯示,蛋白質中央是一個圓柱形水桶樣結構,長420nm,寬240nm,由11個圍繞中心α螺旋的反平行β折疊組成,桶的頂部由3個短的垂直片段覆蓋,底部由一個短的垂直片段覆蓋,對熒光活性很重要的生色團則位于桶的大空腔內。實驗表明GFP熒光產生的前提是桶狀結構完整性,去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸,GFP均會失去熒光。原因是GFP生色團的形成效率較低,而且形成過程受外界環境影響較大。

      綠色熒光蛋白發光原理:

      綠色熒光蛋白GFP的第65至67位的三個氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)殘基,可自發地形成一種熒光發色團。當蛋白質鏈折疊時,這段被深埋在蛋白質內部的氨基酸片段,得以“親密接觸”,導致經環化形成咪唑酮,并發生脫水反應。在分子氧存在的條件下,發色團可進一步發生氧化脫氫,最終成熟,形成可發射熒光的形式。具體過程為:在 O2存在下,GFP分子內第67位甘氨酸的酰胺對第65位絲氨酸的羧基進行親核攻擊,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β鍵脫氫反應之后,導致芳香團與咪唑基結合,并最終自發催化形成對羥基苯甲酸咪唑環酮生色。

      綠色熒光蛋白GFP需要在氧化狀態下產生熒光,強還原劑能使GFP轉變為非熒光形式,但一旦重新暴露在空氣或氧氣中,GFP熒光便立即得到恢復。一般來說弱還原劑并不會影響GFP熒光,中度氧化劑如生物材料的固定,脫水劑戊二酸或甲醛等對GFP熒光影響也不大。

      綠色熒光蛋白GFP的結構

      綠色熒光蛋白發光特性:

      GFP吸收的光譜更大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副吸收峰(藍光);發射光譜更大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側峰(Shouder)。雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于該激發光對細胞的傷害更小,因此通常多使用該波段光源(多為488nm)。此外,GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩定,在激發光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素強,特別是在450~490nm藍光波長下更穩定。類似的,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高,抗光漂白能力強,因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產生不需要任何外源反應底物,因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白,比如螢火蟲熒光素酶等。

      綠色熒光蛋白的應用:

      廣泛應用于分子標記,體內示蹤,信號轉導,藥物篩選等生物科研的各個方面。


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