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      熒光蛋白載體構建和基因轉入

      作者:生命科學事業部時間:2019-12-20 13:15:03瀏覽694 次

      信息摘要:

      熒光蛋白融合表達產物可以通過適當的載體瞬時或者穩定的轉入到哺乳動物和其他細胞中。在瞬時轉染中,基因轉染實驗(通常指的是瞬時轉染),質?;蛘卟《镜腄NA并不需要跟寄主組織的染色體整合,但是需要在一個短時期內在細胞質中表達?;蛉诤袭a物的表達情況可以很容易的通過檢測熒光發射情況觀察,一般在質粒DNA轉染到哺乳動物細胞后72-96h后即可觀察。在很多情況中,質粒DNA可以和基因組穩定的整合到一起。瞬時或者穩定轉染主要依賴于所研究的目標生物的種類。

      熒光蛋白的功能非常多,在從微生物學到系統生理學的整個生命科學領域中得到了成功的應用。這些獨有的探針在培養的細胞核組織和活體動物中作為基因表達的報告基因得到了非常多的應用。在活細胞中,熒光蛋白是追蹤蛋白質、組織和其他細胞成分定位和動態變化最常用的工具。已經有很多技術被開發出來用于構建熒光蛋白融合產物和提高他們在哺乳動物和其他系統中的表達。最主要的引入熒光蛋白方法就是將熒光蛋白的基因序列構建到細菌質粒和病毒載體中,然后轉入細胞體內。

      熒光蛋白融合表達產物可以通過適當的載體瞬時或者穩定的轉入到哺乳動物和其他細胞中。在瞬時轉染中,基因轉染實驗(通常指的是瞬時轉染),質?;蛘卟《镜腄NA并不需要跟寄主組織的染色體整合,但是需要在一個短時期內在細胞質中表達?;蛉诤袭a物的表達情況可以很容易的通過檢測熒光發射情況觀察,一般在質粒DNA轉染到哺乳動物細胞后72-96h后即可觀察。在很多情況中,質粒DNA可以和基因組穩定的整合到一起。瞬時或者穩定轉染主要依賴于所研究的目標生物的種類。

      在熒光蛋白基因轉移實驗中的基本的質粒載體結構中有幾個是必須具備的。質粒中必須含有編碼細菌DNA復制起始原點的核苷酸序列和抗性基因。這些組成部分通常叫做穿梭序列,可以使質粒在細菌寄主中選擇和繁殖,以產生用于哺乳動物轉染的多種載體。除此之外,質粒還必須含有一個或多個真核的基因序列來控制mRNA轉錄起始,哺乳動物的多聚腺苷酸化信號,一個內含子(可選),和一個在哺乳動物細胞中共選擇的基因。轉錄元件在哺乳動物寄主表達感興趣的基因融合產物是必要的,選擇性基因通常是抗生素抗性基因,是含有質粒的細胞可以再抗生素存在條件下生長。這些組成部分會根據質粒設計的不同而改變,很多載體有很多別的組成部分可以適用于特殊的用途。

      圖7所展示的是一個商用的改造過的包括酶切位點和基因分布細菌質粒的圖譜。這個質粒中包含有增強型黃色熒光蛋白的編碼序列,它同內質網鈣結合蛋白融合到一起(一個常駐蛋白)。這個基因在易感哺乳動物細胞中的表達產物和含有EYFP的嵌合肽定位在內質網膜上,專門用于這個組織的熒光標記。主載體是一個pUC的多拷貝(大約500)質粒改造的來的,它包含細菌的復制起點,可以在特定E. coli菌株的復制??强剐曰蚩梢栽诩毦斜磉_可以作為篩選標記。

      這個EYFP載體還包括人類巨細胞病毒的啟動子(CMV)用于基因在人類和哺乳動物細胞中啟動基因的表達,和一個f1噬菌體單鏈DNA產物的復制起點。載體的骨架還包括一個猴病毒(SV40)的復制起點,它在表達SV40的T抗原時有活性??股谿418用于篩選未定的轉化子,它可以被新霉素抗性表達框(包括SV40的早期啟動子,新霉素抗性基因和HSV-TK的多聚腺苷酸化信號)激活。6個單一的限制性酶切位點在圖中標示出,可以使載體的用途更為廣泛。

      熒光蛋白載體構建和基因轉入

      熒光蛋白表達載體的繁殖,分離和轉染

      成功的哺乳動物細胞轉染實驗依賴于高質量的細菌內毒素相對少的質?;虿《綝NA載體。在原始狀態下,環形質粒DNA分子三級超螺旋結構。多年來,超螺旋質粒和病毒DNA的純化主要是通過氯化銫密度梯度離心實現的。這個技術的設備和材料都很貴,根據浮力密度來將質粒(超螺旋)DNA從線性染色體和缺口的環狀DNA中分離出來。近來,簡化的離子交換柱吸附的方法(mini-prep)可以快速的提取出高質量的質粒DNA。

      特殊的細菌突變體,叫做感受態細胞,它已經用于質粒載體的擴增和繁殖中。此種細菌有很多突變體用于質粒的復制,通過化學滲透法將DNA通過細胞膜和細胞壁轉入到細胞內,這一過程叫做轉化。轉化后,細菌在含有抗生素的培養條件下生長到對數生長期。細菌培養物離心收集,用含有RNA酶的堿裂解液裂解。裂解后加入中和液中和離心,再將上清液過離子交換柱,其他雜質如RNA,DNA和蛋白都被洗掉,溶解在高鹽溶液中,然后用乙醇或異丙醇沉淀溶解的質粒DNA,離心,洗滌,再溶解。純化好的DNA就用于轉染實驗中。

      熒光蛋白表達載體的繁殖,分離和轉染

      哺乳動物細胞的轉染必須在非常好的生理條件和對數生長期完成,很多已經商業化生產轉染用試劑可以優化培養細胞吸收質粒DNA的條件。這些技術包括從簡單的磷酸鈣沉淀法到脂質體法(將質粒DNA包裝在與細胞膜融合的脂質體中再轉入到細胞質中)。脂質體轉染技術已經在很多轉染實驗中得到了廣泛的應用,是目前大部分轉染實驗所采用的方法。

      雖然瞬時轉染通常導致在相對短的時期內質?;虍a物丟失(若干天),但是穩定轉染細胞系要在很長時間才能獲得(幾個月到數年)。穩定的細胞系可以通過質粒骨架上含有的抗性基因進行篩選。哺乳動物細胞系中最常用的篩選抗生素是蛋白合成抑制藥物G418,但是在每一個細胞系中的用量是不同的。另一個常用的抗生素,包括潮霉素和嘌呤霉素,已經用于穩定細胞的選擇。獲得穩定細胞系的最有效的方法是起始轉染是采用高效的方法。在這點上,電穿孔法已經被證實是用線性質粒獲得穩定轉染細胞。通過短暫的高電場電脈沖處理細胞,沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電穿孔法需要特殊的儀器設備,但是,當大量轉染時,這個耗費跟脂質體轉染所用試劑的消耗是差不多的。


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